Dall’assegnazione varietale per scopi vivaistici a programmi di miglioramento genetico per creare nuove varietà con importanti caratteristiche intrinseche (resistenza alle patologie, caratteri qualitativi), nonché alla valorizzazione delle risorse genetiche autoctone creando canali, segmenti o nicchie di mercato in grado di aumentare il margine di guadagno delle piccole-medie imprese agricole. Inoltre, potrebbe prendere corpo un network tra gli istituti agrari che detengono le collezioni esaltando le potenzialità delle risorse genetiche autoctone. Questi, in estrema sintesi, gli scopi di un filone del progetto Bionet 2017-2022, finanziato con fondi Psr e coordinato da Veneto Agricoltura.
Oggetto dello studio sono quattro collezioni di germoplasma appartenenti agli istituti agrari Parolini di Bassano, Della Lucia di Feltre e Stefani-Bentegodi di Verona e Veneto Agricoltura, per lo studio delle vecchie varietà di melo tramite l’impiego di marcatori molecolari (SSRs), al fine di disporre di un profilo molecolare o impronta genetica varietale (fingerprint), propedeutico all’iscrizione all’Anagrafe nazionale delle risorse genetiche di interesse agrario. Il Programma Bionet completo si articola in 14 gruppi di lavoro che comprendono lo studio delle risorse animali e vegetali concorrendo alla gestione diretta di otto centri di conservazione per gli animali e 16 campi catalogo per i vegetali.
Patrimonio da tutelare
Nelle quattro collezioni gestite da Veneto Agricoltura e dagli istituti agrari aderenti al progetto sono conservate decine di vecchie varietà di melo, costituenti un corpus genetico di straordinaria importanza. Le accessioni sono state raccolte e catalogate nel tempo secondo le metodiche di determinazione fenotipica che si basano cioè sullo studio e l’analisi dei parametri visibili e osservabili a occhio nudo come ad esempio la forma del frutto, la colorazione dell’epicarpo, la struttura dell’ovario e altri. Molte di queste cultivar mancano però di una determinazione varietale vera e propria e si fregiano spesso di nomi di fantasia, creando a loro volta un circuito di malinteso e di errore tassonomico. Forse anche per una scarsità di fonti storiche bibliografiche derivanti dalle poche pomologie e trattati di frutticoltura presenti in Italia rispetto ad altri Paesi.
Il primo passo nella gestione delle risorse genetiche custodite nelle quattro collezioni è stato stilare una lista completa di tutte le varietà conservate arrivando a contarne oltre 200 a cui è seguita la fase di reperimento delle informazioni bibliografiche, analizzando biblioteche pubbliche e private o enti che potevano sopperire alla scarsità di informazioni. Così un ruolo importante è stato giocato dagli archivi di alcuni vivaisti attivi fino agli anni ’60 del secolo scorso, da cui si è potuto evincere quante e quali varietà erano in auge nel territorio veneto fino alla metà del secolo scorso. L’elenco redatto ha permesso di prendere visione delle varietà storiche coltivate in Veneto e compararlo con quello che è il numero di varietà ancora esistenti e attualmente conservate nelle collezioni regionali.
A tal proposito sono state sondate 21 opere bibliografiche coprendo un arco di tempo che va dal 1797 al 1950 per poter, previa caratterizzazione genetica, iscrivere le varietà alla Anagrafe nazionale della biodiversità di interesse agrario e alimentare (L. 194/2015). Su un totale di 197 genotipi presi in considerazione è stato possibile assegnare un riferimento bibliografico a 153 varietà, mentre per 44 non è stato possibile trovare nessun riferimento bibliografico. Il rapporto tra i campioni che dispongono di un’informazione bibliografica rispetto al totale è pari a 77,66%. Lo studio bibliografico preliminare ha permesso di individuare quali varietà tra quelle conservate nelle quattro collezioni dovevano essere analizzate.
Il prelievo di campioni fogliari ha interessato oltre 200 accessioni, di queste 128 provenienti dalla collezione di Veneto Agricoltura, 59 conservate presso l’Istituto agrario Parolini di Bassano del Grappa (Vi), 39 accessioni dall’Istituto agrario Stefani-Bentegodi di Buttapietra (Vr), 10 accessioni provenienti dalla collezione dell’Istituto Agrario Della Lucia di Vellai-Feltre (Bl). A queste varietà se ne sono aggiunte altre sei provenienti da una collezione privata di Lusiana (Vi) per poter meglio discriminare, mediante analisi genetica, alcune cultivar conservate di ambigua assegnazione varietale.
Come si estrae il Dna
Da un punto di vista analitico i microsatelliti o comunemente detti short sequence repeats (SSRs) sono lo strumento scientificamente riconosciuto più idoneo e da un punto di vista diagnostico più affidabile e riproducibile. Si basa sulla presenza nel Dna genomico di brevi regioni o sequenze altamente ipervariabili che contengono brevi (2-5 bp) motivi ripetuti in tandem (GATA – GCC – ATT). Questa ipervariabilità nelle regioni di Dna risulta altamente individuale e può essere impiegata, nel caso del melo, come strumento diagnostico in quanto caratteristica della varietà di appartenenza e può quindi essere applicato per la determinazione varietale.
Dai campioni fogliari prelevati da ciascuna delle quattro collezioni si è provveduto ad allestire presso il laboratorio di Biotecnologie di Veneto Agricoltura, sede di Thiene (Vi) l’estrazione del Dna, impiegando un kit di estrazione (Makerei-Nagel) (foto 2B), da cui è stata evidenziata la presenza del Dna genomico estratto dai campioni tramite corsa elettroforetica su gel di Agarosio 0.5% (foto 2C)
Per l’ottenimento del profilo genetico varietale, il Dna estratto dai campioni fogliari, è stato processato tramite Pcr (Polymerase Chain Reaction) – utilizzando Mastercycler gradient (Eppendorf) e investigando il Dna genomico su 14 regioni microsatellitari secondo il protocollo proposto da Liebhard et al., (2002). I frammenti amplificati nelle regioni genomiche prescelte sono stati successivamente separati tramite sequenziatore Genetic Analyzer AB3130 (Applied Biosystem), evidenziando i picchi corrispondenti ai frammenti di diversa lunghezza. Per la messa a punto della metodica molecolare sono state impiegate cinque varietà di riferimento prelevate dalla collezione di Sasse Rami (RO). Le varietà prelevate sono state Golden Delicius, Red Delicius, Gala, Granny Smith e Fuji.
Per una corretta assegnazione varietale si è optato per il metodo comparativo ovvero comparare il profilo genetico della varietà oggetto di studio con i profili molecolari di numerose varietà riuniti in una banca dati di sicura assegnazione tassonomica in quanto le stesse varietà sono state geneticamente confermate più volte potendo fungere quindi da references. In questo modo la corrispondenza profilo genetico ed assegnazione varietale risulta inconfutabile.
A breve sarà verosimile determinare con esattezza le varietà finora incognite mediante l’indagine genetico-molecolare condotta a Thiene (Vi) nel laboratorio di Biotecnologie di Veneto Agricoltura, migliorando di fatto la gestione interna delle collezioni aderenti al progetto.
